## 破骨细胞诱导分化机制

破骨细胞是一种特殊的多核细胞，来源于造血干细胞，经过分化后形成巨噬细胞，专责于骨吸收过程。RANKL/RANK/OPG信号通路是调节破骨细胞分化的关键环节，精确控制破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，以维持骨骼的稳态。

### RANKL/RANK/OPG信号通路的作用

RANKL（核因子κB受体活化因子配体）被广泛认为是促进破骨细胞成熟和功能活动的重要因子。M-CSF可以诱导破骨前体细胞的细胞膜上表达RANK，使这些细胞与RANKL结合并发挥效应，最终诱导破骨细胞的分化。在体内，破骨细胞的数量相对较少，仅占分离细胞的8%-12%，因此在体外分离和培养存在一定难度。目前，破骨细胞的主要诱导方法有骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

### 破骨细胞诱导实验方法及注意事项

#### 骨髓单核细胞诱导法

1. 选择8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法进行处理，随后在50mL的75%乙醇中浸泡5分钟以进行消毒。
2. 在无菌条件下，完整取下小鼠的后肢，剔除股骨和胫骨上多余的皮肤及肌肉组织，然后将骨骼放置于10mL含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液中进行清洗。
3. 用含2%青霉素-链霉素的PBS溶液清洗胫骨和股骨两次，确保在整个过程中保持无菌操作，以防止污染。
4. 使用10mL注射器注入α-MEM来冲洗骨髓细胞，并通过70μm细胞筛网过滤至50mL离心管中，反复冲洗至无明显红色残留。
5. 室温下以400×g离心5分钟，去除上清液后加入红细胞裂解缓冲液，静置2-3分钟以裂解红细胞。
6. 加入含10% FBS的α-MEM培养基以终止裂解，离心后弃去上清。
7. 将细胞重悬于含有M-CSF的完全培养基中，转移至培养皿中进行夜间培养。
8. 12小时后收集未贴壁的细胞继续培养，注意适当的接种密度与M-CSF浓度。
9. 持续培养直至贴壁细胞融合度达到80%-90%后，再进行进一步的诱导。
10. 在24孔板中接种骨髓细胞，并换入含有RANKL的培养基进行诱导，培养约6-8天直至破骨细胞形成。
11. 最后，使用TRAP染色试剂盒进行染色，观察形成的多核TRAP阳性细胞。

#### RAW264.7细胞系诱导法

1. 常规培养RAW264.7细胞于含10% FBS的DMEM中，维持在37℃、5% CO2条件下培养，至细胞汇合度达到80%-90%后进行传代。
2. 使用含10% FBS的α-MEM将RAW264.7细胞制成悬液，于24孔板中接种。
3. 接种后12小时加入RANKL诱导因子，注意RANKL的浓度应根据相关文献进行调整，以获得最佳的诱导效果。
4. 每3天更换培养基，并补加RANKL。
5. 多核破骨细胞通常在培养4-6天后形成，即可进行TRAP染色以确认破骨细胞的存在。

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